追趕微生物組的熱潮,你準備好了嗎?(下)[創新技巧]

【字體: 時間:2015年04月03日 來源:生物通

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  有了新型的測序儀,人們開始著手研究健康的人體中生活著哪些類型的微生物。當然,同樣是健康的人,你和我的微生物群落就大不相同,就算同一個人,不同部位的微生物也大相徑庭。這種差異性使得人們難以描述“正常的”微生物組。于是,研究人員從數百名個體中采樣,提取信息。他們關注各個部位,包括口腔、皮膚、鼻腔、腸道,以及泌尿生殖道。

在了解了這些小伙伴是誰之后,我們自然要問,它們在干什么?

它們在干什么?

通過16S擴增子測序,我們大致了解了它們是誰,但我們并不知道它們在干什么。即使是單一物種,微生物也不盡相同。它們往往有著不同的基因,行使著不同的代謝功能。正因為如此,我們需要鳥槍法宏基因組學,來揭示整個群落的生物學功能。

鳥槍法測序,指的是對從微生物群落中提取出的DNA片段進行測序。這種方法代表了完整的細菌基因組,因此幾乎不受鑲嵌性和偏向的影響。它還包含了更多信息,可對近親和遠親做出準確的系統發育推斷。然而,最實質性的優勢是它提供了細菌群落中存在的基因信息。

早前,一個國際研究團隊對36個沙眼衣原體分離株的基因組進行了測序,并開展系統發育分析。結果表明,過去利用ompA來預測系統發育結構從而對衣原體進行分類是誤導性的,因為這一區域的廣泛重組掩蓋了真正的關系。(延伸閱讀:Nature Genetics:衣原體原本的分類不可靠

對于病毒微生物組的研究,全基因組測序也是個不錯的選擇,因為病毒中沒有相應的16S。人們往往使用Illumina測序,有時還結合Pacific Biosciences的長讀取測序,深入了解病毒微生物組,看看它們包含哪些基因。

測序流程也與平常的DNA測序相似,包括DNA提取、文庫制備、測序及數據分析,不過在樣品處理時需要特別留心,因為制備和儲存過程可能會影響結果。在一些微生物組樣品中,宿主DNA占了絕大部分,甚至高達99%,這為微生物樣品的分析帶來了難題。微生物的測序讀取僅僅占了極小的一部分。若想獲得足夠高的序列覆蓋度,要么是費用上不允許,要么是技術上不可行。

NEB的NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit則解決了這一難題。它能夠有效去除高達98%的甲基化宿主DNA(包括人類DNA),而保留無CpG甲基化或極少CpG甲基化的微生物DNA,從而將微生物組DNA的測序費用降低至更合理的水平。

Zymo也推出了室溫的核酸穩定劑DNA/RNA Shield。它能夠確保樣品儲存或運輸過程中的核酸穩定性。DNA/RNA Shield裂解細胞并讓核酸酶和病毒失活,否則樣品的組成很可能會發生變化。

當然,真正的困難在于數據分析這一部分。有時,你會發現兩個相近的大腸桿菌菌株有著截然不同的功能內容,而不同的分類群卻有著相同的功能內容。究其原因,大抵是參考基因組缺乏,而那些現有的參考基因組又缺乏足夠的注釋。

人類微生物組計劃(HMP)的目標之一就是獲得3000種微生物分離株的參考基因組序列。這一計劃由美國NIH資助,通過16S和WGS宏基因組學研究來認識多個人體部位微生物群落的復雜性,包括鼻腔、口腔、皮膚、胃腸道和泌尿生殖道,并了解人類微生物組的改變如何與健康或疾病相關聯。


如今,我們已經對微生物組有了一定的了解,但還有很多事情是我們不明白的。比如,通過研究“它們是誰”,研究人員發現幾乎所有健康的人也攜帶了能引起疾病的微生物。那么,究竟是什么讓它們變節呢?通過研究“它們在干什么”,研究人員發現微生物所提供的功能對保持人體健康至關重要。這又帶來了微生物組如何隨時間變化,群落如何保持平衡,以及這種變化如何影響人類健康的問題。未來,路還很長。

陷阱重重

然而,在這股微生物組研究的熱潮背后,也存在著重重陷阱,讓我們不得不時刻保持清醒的頭腦。

研究的結果是否可靠嗎?這還真不好說。BMC Biology雜志上的一項研究指出,許多已發表的微生物組研究其實受到了污染,錯誤地報告了來自于環境的雜菌。研究人員發現,DNA提取試劑盒、化學試劑和實驗室環境中的雜菌都可能影響微生物組分析的結果。因此,陰性對照必不可少,而在樣本采集過程中也要盡量降低污染的可能性。

去年8月,Nature雜志也發表評論文章,對微生物組的熱潮進行了反思。文章指出,在接受一項新結論之前,我們首先應提出五個問題。

研究有沒有檢測到有意義的差異?正如我們之前所說的,16S rRNA分析能提供門、屬、種的信息,但這種分類還不夠細。即使是單一物種,微生物也不盡相同。它們往往有著不同的基因,行使著不同的代謝功能。這需要更加深入的代謝物圖譜分析。

研究是否明確了因果關系?早前一項發表在Gut上的文章就引起了爭議。研究人員通過對職業橄欖球運動員的研究發現,運動也能影響腸道微生物組。然而,有研究人員認為,這些結果可能只是相關性,而非因果關系。

作用機制是什么?研究者們可以通過設計,精確限定微生物組中的成分,建立缺乏某一類微生物的菌群,或者利用“芯片上的器官”測定微生物組的生化活性。

研究是否足以反映真實情況?就算微生物組在實驗中能夠影響健康,也可能并不是造成患者癥狀的主要原因。

結果是否可能有別的解釋?我們有充分的理由相信,細菌正通過多種途徑對我們施加影響。但是也有許多其他因素(可能更重要)在起作用,比如飲食。

因此,我們有必要抑制沖動,冷靜思考,更加合理地設計和開展實驗。在追趕微生物組熱潮的同時,多一點懷疑和批判精神也是很有必要的。(生物通 余亮)

延伸閱讀:

追趕微生物組的熱潮,你準備好了嗎?(上)

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