傾聽細胞的私語:exosomes研究工具盤點(一)

【字體: 時間:2016年03月22日 來源:生物通

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  大家都知道,細胞不斷地向細胞外空間分泌各種囊泡、大分子及小分子。至于分泌哪種類型的囊泡,這要看心情,哦不,要看細胞的來源以及它們目前的狀態。近年來,一種微型的囊泡正受到越來越多的關注,這就是exosomes,又稱外泌體。

大家都知道,細胞不斷地向細胞外空間分泌各種囊泡、大分子及小分子。至于分泌哪種類型的囊泡,這要看心情,哦不,要看細胞的來源以及它們目前的狀態。近年來,一種微型的囊泡正受到越來越多的關注,這就是exosomes,又稱外泌體。

這種直徑在30至150 nm的小囊泡天然存在于各種體液中,包括血液、唾液、尿液以及母乳。它們像一輛輛小卡車,攜帶了精心安排的RNA和蛋白貨物,在許多生物過程中發揮了不同的作用和功能,比如抗原呈遞、程序性細胞死亡、血管生成和炎癥等。

其實,在過去很長一段時間內,exosomes一直坐在冷板凳上。人們認為,那些貨物不過是些垃圾袋而已。幾年前,人們才意識到,exosomes實際上擔當了真核細胞之間的通訊作用。核酸是帶電荷的分子,無法穿過細胞膜,于是這些囊泡為改變細胞的轉錄組助下一臂之力。

通俗地說,exosomes就像病毒一樣,將內源的遺傳物質從一個細胞傳遞到另一個細胞。以microRNA miR-451為例,腫瘤瘋狂地釋放miR-451,并將其裝入囊泡。當周圍的細胞獲得這些囊泡,它們就收到了一堆轉錄本,使得細胞狀態更有利于腫瘤生長和血管生成,從而促進了腫瘤的發展。而這僅僅是一個分子。從整體上看,細胞中也有一個社交網絡。它們不斷交換囊泡,交流大量的信息。

至于細胞間交流了什么,這也是研究人員感興趣的地方。他們認為,exosomes有望作為生物標志物,用于疾病的診斷和治療。在此方面,exosomes又格外有吸引力,因為外界的核酸酶和蛋白酶無法破壞它的貨物,囊泡內的大分子在一段時間內是穩定的。

當然,我們需要工具,來研究exosomes。幾年前,這方面的工具還相當少。隨著exosomes研究熱潮的涌現,如今我們的選擇也越來越多了。

分離exosomes

對于許多研究而言,我們首先要分離出exosomes。經典的方法是超速離心。具體操作是,首先以相對低的速度沉淀樣品,去除細胞碎片,然后逐步提高速度,最終以100,000 x g離心1.5小時,以沉淀exosomes。不過,這種方法耗時耗力,也很難標準化,因為各個實驗室的轉子不同,離心條件不同。這就使得實驗室之間的結果幾乎沒辦法比較。而且,并非每個實驗室都能用上超速離心機。

好在,市場上出現了多款方便的試劑盒。比如,賽默飛世爾科技推出了幾款總exosomes提取試劑盒(Total Exosome Isolation Reagent),能夠分別從細胞培養基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離出完整的exosomes。獲取詳細資料>>
 
這種新穎的試劑通過捆綁水分子,將溶解度不太高的組分(如囊泡)擠出溶液,從而可通過常規的低速離心來收集。據賽默飛世爾介紹,這幾款試劑都采用相同的核心成分,但針對不同的樣品分別進行了優化。比如,血漿樣品就比血清更具挑戰性,因為它含有高水平的凝血因子,不建議將產品混用。

通過這種方法獲得的產物包含了全部exosomes,不過對于血清等體液,可能也含有少量共沉淀的其他小囊泡和蛋白分子。對于大多數應用而言,這種純度已足夠,而且它的優勢也很明顯:流程簡單快速,無需特殊設備,可處理少量樣品(如100 μl),通量高。

如果你需要更高的純度,可以使用Dynabeads磁珠來捕獲表達CD9、CD63、CD81或EpCam的exosomes。這個額外的步驟無疑將增加操作時間,而exosome的總產量也將降低,但對于那些需要超純exosomes的項目而言,這是最佳選擇。超順磁的Dynabeads呈淺棕色,因此在整個操作過程中都可以“看見”你的樣品。另外,你也可以通過生物素化的抗體和鏈霉親和素試劑來富集你感興趣的亞群。

Exosome Diagnostics公司也開發出一種基于離心柱的簡便方法來分離細胞外囊泡(EV),并提取出其中的RNA。目前,基于此技術的商業化產品 – exoEasy Maxi Kit已由QIAGEN推出。

這種方法使用了膜親和結合步驟來分離exosomes及其他EV。它運用了囊泡的通用生化特性來提取樣本中的所有細胞外囊泡,無法通過大小或細胞來源對EV進行區分,也不依賴于是否存在微粒表位。因此,在開始提取前需要對樣品進行離心或過濾操作,以便完全去除細胞、細胞碎片、凋亡小體等組分。

整個流程僅僅需要25分鐘。將預先過濾的血漿、血清或細胞培養上清與緩沖液混合并結合在exoEasy膜親和離心柱上。對結合的EV進行洗滌和洗脫,即可用于物理或生化分析。不過,對于生物檢測等特定應用,可能需要進行額外的濃縮或緩沖液置換。此步驟可通過孔徑尺寸為100 kDa或更小的超濾方法來實現。了解QIAGEN的exosomes提取及分析產品

此外,也有不少研究人員嘗試借助超濾膜來純化exosomes。默克密理博的科學家證實,超濾可作為一種高效的方法,從神經母細胞瘤細胞的培養上清中純化exosomes。后續的分析證實了exosomes的存在、exosomes特異的CD63表達,并通過Western blotting鑒定出神經元特異的蛋白,包括APP和Tau-1。

對于15 mL以內的樣品,利用Amicon® Ultra-15 超濾管(10 kDa MWCO)即可獲得優質足量的exosomes。對于200 mL及更大體積的樣品,研究人員開發出新方法,利用Stirred cell氮氣加壓攪拌式超濾杯,僅需1個小時即可完成。具體操作請向默克密理博索取

有了這么多簡便易用的產品,分離exosomes不再是難題。下一步呢,就是各種分析了。關于完整exosomes及其攜帶貨物的分析,我們下回再說。(生物通 余亮)

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